La Pentosa

La vía del fosfato de pentosa es principalmente catabólica y sirve como una vía alternativa de oxidación de la glucosa para la generación de NADPH que se requiere para reacciones biosintéticas reductoras como las de biosíntesis de colesterol, síntesis de ácidos biliares, biosíntesis de hormonas esteroides y síntesis de ácidos grasos.

La vía del fosfato de pentosa también puede funcionar como una vía anabólica que utiliza los seis carbonos de la glucosa para generar cinco azúcares de carbono, particularmente la ribosa 5-fosfato (R5P) que se requiere para la biosíntesis de purina y nucleótidos de pirimidina.

La vía del fosfato de pentosa puede, bajo ciertas condiciones, oxidar completamente la glucosa a CO2 y agua.

Las funciones principales de la pentosa son:

  1. Generar equivalentes reductores, en forma de NADPH, para reacciones de biosíntesis reductivas dentro de las células.
  2. Proporcionar a la célula ribosa 5-fosfato (R5P) para la síntesis de los nucleótidos y ácidos nucleicos.
  3. Aunque no es una función significativa de la PPP, puede operar para metabolizar los azúcares de pentosa dietética derivados de la digestión de ácidos nucleicos, así como para reorganizar los esqueletos de carbono de los carbohidratos dietéticos en glicolíticos y/o gluconeogénicos intermedios.

Las enzimas que funcionan principalmente en la dirección reductora utilizan el par de cofactores NADP+/NADPH como sus co-factores, a diferencia de las enzimas oxidativas que utilizan el par de cofactores NAD+/NADH.pentosas

Las reacciones de la biosíntesis de ácidos grasos y la biosíntesis de esteroides utilizan grandes cantidades de NADPH. Como consecuencia, las células del hígado, el tejido adiposo, la corteza suprarrenal, los testículos y la glándula mamaria lactante tienen altos niveles de las enzimas PPP.

De hecho, el 30% de la oxidación de la glucosa en el hígado se produce a través de la PPP. Además, los eritrocitos utilizan las reacciones del PPP para generar grandes cantidades de NADPH utilizado en la reducción del glutatión (ver abajo).

La conversión de ribonucleótidos en desoxirribonucleótidos (a través de la acción de la ribonucleótido reductasa) requiere NADPH como fuente de electrones, por lo tanto, cualquier célula que prolifere rápidamente necesita grandes cantidades de NADPH.

Aunque el PPP funciona en todas las células, con altos niveles de expresión en los tejidos indicados anteriormente, los niveles más altos de enzimas PPP (en particular glucosa 6-fosfato deshidrogenasa) se encuentran en neutrófilos y macrófagos.

Estos leucocitos son las células fagocíticas del sistema inmunológico y utilizan NADPH para generar radicales superóxidos a partir del oxígeno molecular en una reacción catalizada por el complejo de la NADPH oxidasa.

El anión superóxido, a su vez, sirve para generar otras especies reactivas de oxígeno (ROS) que matan a los microorganismos fagocitados. Tras la exposición a bacterias y otras sustancias extrañas, se produce un drástico aumento del consumo de O2 por parte de los fagocitos.

Este fenómeno se denomina ráfaga oxidativa o ráfaga respiratoria.

Ingeniería de la utilización de azúcar pentosa exógena en levaduras

Ensamblaje de la vía por expresión génica heteróloga

La levadura de panadería es un huésped ideal para la fermentación industrial; sin embargo, posee poca o ninguna capacidad metabólica de xilosa o arabinosa. Curiosamente, el genoma de S. cerevisiae está codificado con una vía metabólica de xilosa putativa, aunque el nivel de expresión de estos genes suele ser demasiado bajo para permitir el crecimiento de la xilosa como única fuente de carbono.

Un trabajo reciente sugiere que algunas cepas de Saccharomyces pueden poseer una vía de oxidoreductasa latente con una activa xilitol deshidrogenasa. Sin embargo, se demostró que esta vía era reprimida por otras presuntas xilitol deshidrogenasas, lo que ilustra mecanismos de control únicos y potencialmente trans-accionantes.

Aún así, la levadura carece de vías de utilización efectivas de xilosa y arabinosa, y por lo tanto requiere complementación heteróloga o modificación genética significativa.

Vías de la oxidoreductasa

Las vías de la oxidoreductasa pentosa se conservan entre ciertas especies de hongos nativos, y emplean enzimas comunes y cofactores redox para catalizar la conversión del sustrato. La vía de la xilosa oxidorreductasa fue la primera vía pentosa heteróloga construida en la levadura de panadería.

En esta vía, representada en la Figura 1, la xilosa se reduce a xilitol por una aldosarreductasa (AR), luego el xilitol se oxida a xilulosa por la xilitol deshidrogenasa (XDH). El AR más comúnmente utilizado es codificado por Pichia stipitis XYL1 (xilosa reductasa, XR) que prefiere el cofactor NADPH sobre NADH. El XDH está codificado por P. stipitis XYL2, que es dependiente de NAD+.

Vías de isomerasa

A diferencia de la vía de la oxidoreductasa pentosa, las variantes de la vía de la isomerasa no requieren cofactores. La vía es nativa de las especies bacterianas y de las levaduras raras.

La vía heteróloga de la isomerasa xilosa consiste mínimamente en una enzima, la isomerasa xilosa (XI), que convierte directamente la xilosa en xilulosa. Debido a que la mayoría de los XIs son nativos de las bacterias, existen dificultades para la expresión heteróloga en la levadura, sin embargo, trabajos recientes han demostrado vías funcionales de XI bacteriano.

Además, la bioprospección ha producido XIs funcionales heterólogos aislados de hongos raros. Al igual que con la vía de la oxidoreductasa, la complementación de una xilulokinasa puede mejorar aún más los rendimientos y las tasas de asimilación.

Esta vía ha mejorado los rendimientos de conversión del etanol en comparación con la vía de la oxidoreductasa; sin embargo, las cepas tienen tasas de crecimiento más bajas y tasas de absorción de azúcar, como se verá más adelante. Sin embargo, esta vía es atractiva por su falta de desequilibrio de cofactores.pentosa

Optimización de los pasos de limitación

El trabajo descrito anteriormente establece vías viables de utilización de la pentosa en la levadura de panadería, permitiendo que la xilosa y la arabinosa se utilicen como una única fuente de carbono.

Sin embargo, las tasas de crecimiento notificadas siguen siendo inferiores a las óptimas para la producción económica de biocarburantes a partir de biomasa lignocelulósica.

Esta limitación ha conducido a nuevas mejoras de las vías heterólogas tanto por los enfoques tradicionales de ingeniería metabólica como por la expresión heteróloga del transportador molecular.

Vía interna

Cuando la vía de la xilosa oxidorreductasa se expresa en S. cerevisiae, varios factores limitan la producción de etanol, siendo el principal el desequilibrio de cofactores. XR tiene una especificidad mayor para NADPH que para NADH (Km = 3.2 μmol/l para NADPH y Km = 40 μmol/l para NADH) y XDH utiliza sólo NAD+.

En la levadura, existe una disparidad entre la cantidad y accesibilidad de NADPH y NADH intracelular para las enzimas de la vía xilosa. Esta disparidad podría deberse a la competencia por NAD+ de otras enzimas metabólicas endógenas o a la ineficiencia de las enzimas de la vía xilosa.

Como resultado, se pueden producir grandes cantidades de xilitol. Un grave desequilibrio de cofactores (con dos NADPH y dos NAD+ requeridos) limita la vía de la arabinose oxidoreductase. Como resultado, esta vía exhibe un pobre crecimiento celular o poca producción de etanol, aunque las enzimas se expresan activamente.

Transporte

El transporte de azúcar a través de la membrana no limita significativamente el metabolismo endógeno de azúcares como la glucosa, aunque puede limitar el metabolismo de la pentosa exógena.

Sin ninguna modificación genética, la levadura de panadería transportará pentosas a través de la membrana celular a través de una de las muchas proteínas nativas de transporte de hexosa: las proteínas S. cerevisiae Hxt7p, Hxt5p, Hxt4p, Hxt2p, Hxt1p y Gal2p.

Sin embargo, estas proteínas tienen una afinidad mucho mayor con sus sustratos de hexosa nativos, lo que puede crear una inhibición competitiva desfavorable y conducir a un crecimiento diauxico en una cofermentación de hexosa-pentosa.

Por lo tanto, el transporte dedicado de pentosa proporciona una oportunidad para mejorar el uso simultáneo de hexosas y pentosas.

Referencias